Суправитальный метод окраски применяется для выявления

Подсчет ретикулоцитов в крови

Суправитальный метод окраски применяется для выявления

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные стекла.
  2. Шлифованные предметные стекла.
  3. Влажная камера.
  4. Смесители для белых и красных кровяных телец.
  5. Стекла с луночкой.
  6. Микроскоп.
  7. Бриллианткрезиловая синька.
  8. Абсолютный этиловый спирт.
  9. Метиловый спирт или смесь Никифорова (равные части этилового 96° спирта и эфира).
  10. Реактив Гайема или 3% раствор поваренной соли.
  11. Иммерсионное масло.
  12. Набор инструментов для укола в палец.

В зависимости от строения зернисто-сетчатой субстанции различают пять видов ретикулоцитов: пылевидный, венчикообразный, неполносетчатый, полносетчатый и клубкообразный (см. рис).

Различные группы ретикулоцитов по степени зрелости

Взятие крови с целью подсчета в ней ретикулоцитов производят по указанию врача. Чтобы подсчитать количество ретикулоцитов, их окрашивают. С этой целью используют:

  1. Способ прижизненной (суправитальной) окраски ретикулоцитов.
  2. Способ одновременной суправитальной окраски тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву.

Рассмотрим данные способы более подробно.

Прижизненная (суправитальная) окраска ретикулоцитов

Для этого способа необходимы следующие реактивы:

  1. Абсолютный этиловый спирт: в сухую с притертой пробкой посуду помещают прокаленную безводную (белого цвета) сернокислую медь и приливают 1/4 часть абсолютного спирта. Содержимое взбалтывают. Абсолютный спирт (спирт, не содержащий воды) можно получить обезвоживая спирт сернокислой медью, предварительно прокаленной. Обезвоживание прекращают тогда, когда сернокислая медь перестает голубеть.
  2. Насыщенный раствор бриллианткрезиловой синьки в абсолютном спирте: к 80 мл абсолютного спирта прибавляют 1 г бриллианткрезиловой синьки.
  3. Азур I.

Техника прижизненной окраски и подсчета ретикулоцитов

Предметные стекла заранее покрывают насыщенным раствором бриллианткрезиловой синьки. Свежевыступившую каплю крови распределяют по предметному стеклу с краской, как при приготовлении мазка крови.

Препарат немедленно помещают на 6-8 минут во влажную камеру, после чего высушивают на воздухе и микроскопируют (окуляр 7Х, объектив 90X с поднятым конденсором). Ретикулоциты подсчитывают точно так же, как тромбоциты, с ограничителем поля зрения.

Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой, бледно-зеленые с сеточкой голубого или синего цвета (см. рис.).

[attention type=yellow]

Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой

[/attention]

Вместо бриллианткрезиловой синьки для окраски ре тикулоцитов можно использовать, согласно прописи Магиной, краску азур I (1 г азура I на 40 мл абсолютного спирта; выдерживают при комнатной температуре 2 дня).

Одновременная суправитальная окраска тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву

Для этого способа применяют краску Алексеева.

В колбу емкостью 100 мл насыпают 1 г краски азур II и добавляют приготовленный в отдельной колбе реактив следующего состава: 5 г лимоннокислого натрия, 4 г хлористого натрия и 45 мл дистиллированной воды.

Содержимое колбы медленно нагревают на асбестовой сетке при постоянном помешивании, не доводя до кипения. Охлаждают, фильтруют. Фильтрат используют в качестве рабочего раствора краски.

Техника одновременной окраски и подсчета тромбоцитов и ретикулоцитов

В смеситель для лейкоцитов до метки 1,0 набирают краску Алексеева, вытирают кончик от краски и кладут на стол. Производят более глубокий, чем обычно, укол в палец. Кровь набирают до 4/5 объема расширенной части смесителя, следя за тем, чтобы в нее не попадали пузырьки воздуха.

Кровь быстро выдувают из капиллярной части смесителя на ватку, а остальное содержимое — в луночку предметного стекла. С луночки жидкость вновь набирают в смеситель. Двух-, троекратным повторением этой манипуляции смешивают кровь с реактивом.

Набрав последний раз жидкость в смеситель, его оставляют в горизонтальном положении на 15-30 минут для окрашивания ретикулоцитов и тромбоцитов. Затем смеситель встряхивают в течение минуты и выпускают 1-2 капли. Из последующих капель готовят тонкие мазки.

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом и докрашивают краской Романовского в разведении 1-2 капли на 1 мл воды в течение 35-45 минут. Краску смывают водой, а мазки высушивают и микроскопируют. В мазке, окрашенном по Алексееву, ретикулоциты розовые с сеточкой синего цвета (см. рис.), а тромбоциты голубовато-сиреневого цвета.

Ретикулоциты, окрашенные по Алексееву

Подсчет ретикулоцитов и тромбоцитов производят одновременно на 1000 эритроцитов так же, как описано в теме «Тромбоциты». Результаты для ретикулоцитов выражают в promille; тромбоциты рассчитывают на 1 мм3 крови (для расчета учитывают количество эритроцитов, подсчитанных у данного больного).

В крови здоровых лиц насчитывают 5-10 % ретикулоцитов.

Источник: http://ginekolog.my1.ru/publ/klinicheskie_issledovanija/blood/podschet_retikulocitov_v_krovi/39-1-0-760

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями

Суправитальный метод окраски применяется для выявления

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями является на практике наиболее используемым методом подсчета количества ретикулоцитов. Это связано с тем, что метод простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, в связи с чем может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

см. также статьи Ретикулоциты и Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии

Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

Можно использовать один из следующих красителей:

  1. Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.
  2. Раствор азура I: азур I – 1 г, аммония оксалат – 0,4 г, натрия хлорид – 0,8 г, этиловый спирт 96% – 10 мл, дистиллированная вода – 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2 – 3 дня в термостат при 37° C и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.
  3. Раствор азура II: азур II – 1 г, натрия цитрат – 5 г, натрия хлорид – 0,4 г, дистиллированная вода – 45 мл. Раствор оставляют в термостат при 37° C на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15 – 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Микроскоп.

Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

При окраске ретикулоцитов на стекле хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из перечисленных выше красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Стеклографом маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски.

В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Перед проведением анализа готовят влажную камеру. Обычно для этого пользуются чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3 – 10 мин.

Затем высушивают мазки на воздухе.

Окраска ретикулоцитов в пробирке отличается при использовании разных красителей.

Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим

Перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски бриллиантового крезилового синего. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут. Затем снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II

В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут. Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3 – окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I

В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В настоящее время в продаже имеются готовые красители для ретикулоцитов заводского изготовления. Окраска ретикулоцитов с их помощью производится согласно прилагаемой инструкции.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Фотографии ретикулоцитов:

Окраска ретикулоцитов
Ретикулоциты
Ретикулоциты
Ретикулоциты
Reticulocytes

Находят поля зрения, где эритроциты располагаются раздельно. В этих полях зрения необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Большая точность получается при подсчете на 2000 – 3000 эритроцитов.

В связи с тем, что в поле зрения располагается большое количество эритроцитов, что затрудняет подсчет, необходимо ограничить (уменьшить) поле зрения.

[attention type=red]

Для этого можно воспользоваться либо специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров, либо воспользоваться специальным «окошком» (из бумаги вырезают круг диаметром несколько меньше окуляра, в центре круга вырезают небольшой ромбик и вставляют полученное окошко в окуляр).

[/attention]

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 100 (в процентах) или на 1000 (в промилле) эритроцитов.

Пример: При подсчете в мазке 1000 эритроцитов выявлено, что 15 эритроцитов из 1000 имеют зернисто-сетчатую субстанцию той или иной степени, то есть являются ретикулоцитами. Следовательно, количество ретикулоцитов в данном случае составляет 1,5% или 15‰.

Клиническое значение определения количества ретикулоцитов.

  • Справочник “Лабораторные методы исследования в клинике” под редакцией Меньшикова В. В. – Москва, “Медицина”, 1987 г
  • Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы – “Клинические лабораторные исследования” – Москва, “Медицина”, 1984 г.

Метод подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества.

Раздел: Гемоцитология

Читать

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Раздел: Гемоцитология

Читать

Тельца Жолли (тельца Хауэлла-Жолли) – мелкие круглые фиолетово-красные включения размером 1 – 2 мкм, встречаются по 1 (реже по 2 – 3) в одном эритроците. Предсталяют собой остаток ядра после удаления его РЭС. Выявляются при интенсивном гемолизе и “прегрузке” РЭС, после спленэктомии, при мегалобластной анемии..

Раздел: Гемоцитология

Читать

Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Раздел: Цитохимия

Читать

Метод Нечипоренко в отечественной лабораторной диагностике является наиболее распространенным методом количественного определения форменных элементов в моче.

Этот метод наиболее прост, доступен любой лаборатории и удобен в амбулаторной практике, а также имеет ряд преимуществ перед другими известными количественными методами исследования осадка мочи.

По методу Нечипоренко определяют количество форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и цилиндров) в 1 мл мочи.

Раздел: Анализ мочи

Читать

Источник: http://www.clinlab.info/Hemocytology/Reticulocytes-counting-49

Проект

Суправитальный метод окраски применяется для выявления

Вид работы: Проект

Тема: Лабораторные методы исследования ретикулоцитов

ВВЕДЕНИЕ

Ретикулоциты — молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Актуальность темы заключается в том, что ретикулоциты обитают как в периферической крови — так и костном мозге. Их доля повышается при ускорении эритропоэза, а при замедлении — снижается.

У новорожденных ретикулоцитов больше, чем у взрослого человека. Количество их прямо пропорционально скорости производства эритроцитов в костном мозге. Подсчет производится для оценки активности эритропоэза.

Объект исследования – методы исследования и подсчета ретикулоцитов.

Предмет исследования – разнообразие лабораторных методов исследования и подсчета ретикулоцитов.

Цель исследования: изучить разнообразные лабораторные методы исследования ретикулоцитов.

Задачи исследования:

  1. Обозначить методы исследования и подсчета ретикулоцитов;
  2. Изучить особенности окраски и подсчета ретикулоцитов;
  3. Приобрести практические навыки проведения общего клинического анализа крови.

В качестве методов исследования в курсовой работе были использованы: обзорный, статистический, аналитический и систематический методы.

Характеристика ретикулоцитов

Ретикулоциты — это молодые формы эритроцитов, образовавшиеся из нормобластов после потери ими ядра (безъядерные, незрелые эритроциты), созревание которых происходит в течение 24-48 ч после выхода в периферическую кровь из костного мозга, и отражающие регенеративную способность костного мозга (т.е. эритропоэтическую активность костного мозга).

В нормальных условиях часть полихроматофильных нормоцитов теряют ядро, превращаясь в ретикулоцит. Он является незрелым эритроцитом.

В нем определяется сетчатая субстанция, которая является артефактом и состоит из агрегированных митохондрий, комплекса Гольджи, рибосом и других органелл, которая при прижизненной окраске (бриллиантовым крезиловым синим, акридиновым оранжевым) выявляется в виде сетчатой субстанции. В мазках, окрашенных обычным способом, сетчатая субстанция не видна, и эритроциты имеют полихроматофильную окраску.

[attention type=green]

Образовавшийся в КМ ретикулоцит пребывает в нем 36-44 часа, а затем попадает в кровь, где дозревает в течение 24-30 часов.

[/attention]

В период пребывания ретикулоцитов в КМ в них происходит синтез большого количества белковых фракций, входящих в состав мембран, синтез липидов и гема.

Костномозговые ретикулоциты, каково бы ни было их абсолютное количество, образуют небольшой резерв красной крови. По ретикулоцитозу судят об эффективности эритропоэза. ретикулоцитов в норме 0,8-1,3, до 0,2-2 %.

Весь цикл развития от эритробласта до ретикулоцита составляет от 3-4 до 5-7 дне​й.

Ретикулоциты обычно крупнее, чем зрелые эритроциты. Цитоплазма ретикулоцитов содержит базофильную сеточку (ретикулум) в виде мелких зерен, отдельных нитей, клубочков и т.п., которая представляет собой агрегированные рибосомы и митохондрии [2].

По степени зрелости различают 5 видов ретикулоцитов:

1) ретикулоциты, имеющие ядро (эритронормобласты), причем зернистость у них располагается в виде плотного венчика вокруг ядра;

2) ретикулоциты, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде клубка или глыбки;

3) ретикулоциты, имеющие зернистость в виде густой сети;

4) ретикулоцитов, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде отдельных нитей;

5) ретикулоциты, содержащие отдельные зернышки.

Следует запомнить: в норме, по Г. А. Алексееву, почти 80% ретикулоцитов относится к IV – V группам.

В норме в периферической крови содержится 0,2 – 1% ретикулоцитов («%» — содержание ретикулоцитов от общего числа эритроцитов). Данный показатель отражает возможность выхода ретикулоцитов в периферическую кровь и их дальне​йшее превращение в зрелые эритроциты (созревание), как вариант нормы, уже в периферической крови (в течение нескольких часов).

[attention type=yellow]

При нормальном эритропоэзе большинство эритроцитов проходит стадию ретикулоцитов в костном мозге [3].

[/attention]

Некоторые авторы отмечают, что у женщин количество ретикулоцитов несколько большее, чем у мужчин. У детей в первые дни жизни количество ретикулоцитов по разным данным может достигать 5 — 10%, а затем уменьшается.

Ретикулоциты важным показателем способности костного Увеличение их периферической крови –ретикулоцитоз, отмечается при гемолитических когда число их доходить до 60% и  более сильно увеличиваясь при кризах), при острых (на 3 – сутки после кровопотери ретикулоцитарный криз), полицитемии, при лечении железодефицитных анемий, через дне​й (3 — после начала антианемического пернициозной анемии, при недостатке кислорода. Наличие количества ретикулоцитов позволяет заподозрить кровотечение (например, больных брюшным язвенной болезнью) [5].

что увеличение ретикулоцитов в периферической крови выражением хорошей регенерации в том случае, одновременно имеется  ретикулоцитоз  и в костном что называют истинным  ретикулоцитозом Отсутствие же повышенного ретикулоцитов в мозге при повышении количества в периферической говорит об усилении ретикулоцитов костного мозга периферическую кровь (ложный  ретикулоцитоз).

Ретикулоцитоз без соответствующей эритронормобластической реакции мозга, наблюдается раздражении отдельных его раковыми или воспалительными очагами.

  • гемолитических анемиях ретикулоцитов может доходить 60% и более сильно увеличиваясь при кризах);
  • острых кровопотерях 3 – сутки после возникает ретикулоцитарный криз), в числе, увеличение ретикулоцитов позволяет скрытое кровотечение у больных болезнью желудочно-кишечного брюшным тифом);
  • малярии;

при полицитемии;

  • при железом железодефицитных анемий несколько дне​й (3 10) после начала лечения пернициозной анемии);
  • остром недостатке кислорода;

при метастазах в костный мозг.

помнить, что случае усиленного эритроцитов доля ретикулоцитов может 50% вследствие завышения числа ретикулоцитов (как было отмечено ранее, ретикулоцитов рассчитывается в % от эритроцитов).

В случаях ля тяжести анемий «ретикулярный индекс», рассчитывают по (% ретикулоцитов х / 45 х где 45 – гематокрит, 1,85- количество необходимых для поступления ретикулоцитов кровь.

Если < 2 говорит о гипопролиферативном компоненте анемии, > 2-3, то увеличение образования эритроцитов [1].

[attention type=red]

приводящим к значения %- содержания ретикулоцитов могут быть следующих препаратов: противомалярийные средства, жаропонижающие фуразолидона маленьких детей), леводопы.

[/attention]

Запомните: ретикулоцитоз, без эритронормобластической костного мозга, при раздражении участков его метастазами или очагами.

Возможной ошибкой подсчете ретикулоцитов может быть ложное завышение наличия:

  • включений эритроцитах (тельца Жолли, малярийные
  • лейкоцитоза;
  • аномальной гемоглобина;
  • гипертромбоцитоза;
  • гигантских тромбоцитов.

Ретикулоцитопения снижение или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения)

Снижение количества отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается:

  • арегенераторных апластических и анемиях;
  • при анемиях, недостаточностью содержания витамина B12, кислоты (микроцитарно-гипохромные мегалобластные анемии);
  • талассемии;
  • при сидеробластной анемии;
  • при метастазах в кость;
  • при болезни и терапии;
  • при цитостатиками;
  • аутоиммунных заболеваниях системы кроветворения;
  • при почек;
  • при алкоголизме;
  • при анемии Аддисона-Бирмера;

Прикрепленные файлы:

-issledovanie_retikulocitov

Rekomendaciya_k_kursovoj20161011183203

Источник: https://xn--d1aux.xn--p1ai/laboratornye-metody-issledovaniya-retikulotsitov/

Сам себе врач
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: