Универсальный дифференциальный метод окраски бактерий метод

Методы окраски бактерий по Граму, Цилю-Нильсену, Нейссеру

Универсальный дифференциальный метод окраски бактерий метод

Мы живем в мире бактерий. Они вокруг нас и внутри нашего организма. Не удивительно, что мы хотим знать о них как можно больше.

Но как рассмотреть и тем более изучить что-то настолько маленькое? Микроскоп, казалось бы, должен решить эту проблему. Но не все так просто – в своем естественном состоянии микроорганизмы прозрачны как стекло.

«Проявить» картинку помогают различные методы окраски бактерий, помогающие исследовать внешнее и внутреннее строение микробов.

Как все начиналось

В конце девятнадцатого века датский биолог Кристиан Грам предложил решение этой проблемы. Если что-то невидимо, его нужно покрасить и посмотреть, что получится. Метод окраски бактерий, предложенный Грамом, был настолько убедителен, что и по сей день микроорганизмы разделяют на грамположительные (удерживающие окраску) и грамотрицательные (обесцвечивающиеся после обработки спиртом).

Как оказалось, клетки покрыты оболочкой, похожей на переплетенные между собой нити.

И хотя в просветы между нитями свободно проходят питательные вещества, необходимые клетке, оболочка надежно защищает «внутренний мир» от внешних агрессивных факторов.

[attention type=yellow]

У разных видов бактерий наружная стенка клетки имеет различную толщину, плотность и химический состав. Именно на этом свойстве клеточных оболочек базируется метод окраски по Граму.

[/attention]

Отталкиваясь от работ Кристиана Грама, биологи разработали новые методы, позволяющие не только определить форму и размер клеток, но и рассмотреть некоторые подробности их строения. Иногда микроорганизмы, совершенно идентичные по внешнему виду, по-разному реагируют на красители. Полученная информация дает возможность быстро и точно определить вид бактерий.

Старый – не значит плохой

Пожалуй, самый практичный и широко применяемый способ окрашивания микроорганизмов – метод Грама. Мазок, зафиксированный огнем, покрывают метиловым фиолетовым красителем, фиксируют йодом, просушивают и промывают спиртом. На этом этапе, в зависимости от свойств клеточной мембраны, бактерии становятся:

  • ярко-синими (грамположительные);
  • бесцветными (грамотрицательные).

Толщина оболочки клеток, оставшихся бесцветными, не позволяет краске проникнуть внутрь, и она легко смывается с поверхности бактерий. Последним шагом окрашивания по Граму является использование красного красителя, он остается на поверхности клеточной мембраны и придает ей розовый или красный оттенок.

Грамположительные бактерии, как правило, опасны для человека. К этой категории относятся стрептококки, стафилококки, бациллы, клостридии и т. д. Грамотрицательные не настолько опасны.

Они тоже могут вызывать болезни и воспаления, но только при определенных условиях.

Таким образом, просто приготовив окрашенный препарат, можно получить представление о степени опасности исследуемых микроорганизмов.

Витальные методы окраски

По состоянию исследуемых организмов в микробиологии существуют:

  • витальный способ, т. е. работа с живыми бактериями (опасен, требует строгого соблюдения техники безопасности);
  • поствитальный метод – работа с фиксированными (убитыми) клетками;
  • негативный, может быть витальным и поствитальным, удобен для работы с капсулами.

Витальный метод, безусловно, самый опасный, так как исследователям приходится иметь дело с живыми клетками, иногда представляющими смертельную опасность. Однако именно такой способ дает возможность изучать не только строение клетки, но и весь ее жизненный цикл и взаимодействие с окружением.

Для многих микробиологических исследований важно сохранить бактерии живыми.

Это значит, что нужно использовать специальные нетоксичные или низкотоксичные красители, к тому же легко проникающие в структуру клетки через наружную оболочку.

Это так называемые витальные красители, они могут быть предназначены для видимого света или флуоресцентными. По химическому составу красители разделяются на:

  • основные (акридиновый оранжевый, метиленовый синий);
  • кислотные или кислые (индигокармин, кислый фуксин);
  • нейтральные (родамин В).

Работа с фиксированными препаратами

По сложности работы методы окраски фиксированных (неживых) клеток разделяются на:

  1. Простые методы. В этом случае используют только одну краску, как правило, красную (фуксин) или синюю (метиленовый синий). Разница между этими красителями состоит в скорости воздействия. Фуксин дает результат уже через 1-2 мин., тогда как результат работы синей краски нужно ждать 3-5 мин. Использовать раствор фуксина в карболовой кислоте (т. н. фуксин Циля) удобно еще и потому, что приготовленный препарат в течение нескольких месяцев не теряет окрашивающих свойств. Метиленовый синий краситель тоже может быть подготовлен заранее в крепком спиртовом растворе.
  2. Сложные (дифференциальные) методы. Здесь потребуется несколько красителей (минимум два), имеющих различный цвет. Это позволит не просто увидеть бактерии, но и подробнее изучить их внутреннее строение, так как различные участки клетки могут по-разному воспринимать красители. К сложным относят методы Грама, Циля – Нильсена (для кислотоустойчивых бактерий), Бениньетти (окраска бактериальных жгутиков), Гинса (выявление капсул), дифференцирующий метод Романовского – Гимзы (окраска спор) и некоторые другие.

Особенно важны сложные методы для диагностики инфекционных заболеваний, например, способ окраски Нейссера помогает отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийных.

Дифференцирующий способ Романовского – Гимзы основан на применении специального готового порошка, на основе которого лаборатории готовят раствор красителя нужной концентрации. Преимущество этого способа в том, что цитоплазма и ядро клетки получают различную окраску, что облегчает идентификацию и изучение микроорганизмов.

Метод Нейссера используют в медицине для обнаружения зерен волютина (гранул с запасом пищи для многих прокариотических клеток) у возбудителей дифтерии. В результате окрашивания бактерия приобретает желтый цвет, а гранулы волютина – синий.

Белым по черному

Еще одна разновидность окраски бактерий основана на свойствах негатива, т. е. на темном фоне препарата четко видны бесцветные бактерии, иными словами, окрашивается среда, а не сам организм.

Иногда бактерии, попадая в определенные условия, образуют капсулы. Это слизистые образования, покрывающие клетку, чем-то похожие на гель. Капсулы прозрачны, их химический состав может сильно отличаться у разных видов бактерий, т.е. просто покрасить и оценить результат по получившемуся цвету не выйдет.

Кроме того, капсулы мягкие и непрочные, при окраске они могут потерять форму. Красящие вещества плохо взаимодействуют с желеобразной структурой капсул и легко вымываются при обработке. Чтобы обнаружить, но не повредить капсулы, пригодится негативный способ окрашивания.

[attention type=red]

Одним из способов выявления капсул является метод окрашивания по Гинсу. Каплю черной туши наносят на край предметного стекла, вносят в нее исследуемый материал, перемешивают и распределяют по всей поверхности.

[/attention]

Мазок сушат на воздухе, фиксируют и окрашивают фуксином Циля. Через 2-3 минуты промывают водой и высушивают.

В результате под микроскопом на общем темном фоне отчетливо просматриваются розовые клетки, окруженные прозрачными капсулами.

Окраска спорообразующих бактерий

Если говорить о клеточных оболочках, то нельзя не вспомнить о спорообразующих бактериях. Споры образуются при неблагоприятных для клетки условиях и могут существовать в агрессивной среде довольно длительное время.

То, что хорошо для сохранения клетки, плохо для ее изучения. Споры очень плотные и почти не пропускают жидкости, кроме того, они кислотоустойчивы. Следовательно, простое окрашивание или метод Грама оставят споры бесцветными.

Перед началом окрашивания приходится химически обрабатывать поверхность спор, чтобы она немного изменила свою структуру и позволила красящим веществам проникнуть внутрь. При этом окрашивается и вся цитоплазма клетки. Чтобы обесцветить цитоплазму, препарат промывают и высушивают. Краска в спорах, благодаря их более плотной структуре задерживается лучше, чем в цитоплазме.

Способы окраски спор могут быть разными, например, Ожешко или Циля – Нильсена, но все они сводятся к одной схеме:

  • разрыхление поверхности спор химическими веществами (кислоты, аммиак, едкий натр);
  • окрашивание клетки со спорой (обычно при нагревании);
  • обесцвечивание цитоплазмы.

В результате получаем отлично видимую ярко окрашенную спору и бледную, почти прозрачную цитоплазму.

Как рассмотреть бактериальные жгутики

Еще одна непростая задача – окраска бактерий со жгутиками. Это спирально закрученные очень тонкие нити, которые микроорганизмы используют для перемещения. Жгутики необычайно тонкие, при окрашивании они легко отрываются от клетки. Поэтому перед началом окрашивания жгутики протравливают, искусственно увеличивая в объеме.

При подготовке микроорганизмов к исследованию бактериальную культуру несколько раз пересеивают на свежую питательную среду в течение нескольких дней. Затем бактерии со жгутиками переносят в пробирку со стерильной водой (t 37⁰С). Делают это предельно осторожно, не перемешивая жидкость, чтобы не повредить жгутики.

Содержимое пробирки оставляют примерно на час, чтобы бактерии равномерно распределились по всему объему. Перед началом исследования проверяют подвижность клеток в висячей капле. Если движения нет, пробирку оставляют еще на некоторое время.

При нанесении раствора на предметное стекло клетки могут легко потерять жгутики. Поэтому поверхность стекла должна быть идеально чистой и обезжиренной. Перед нанесением капель раствора предметное стекло проводят над горячей частью пламени горелки, чтобы попавшие на поверхность капли расплылись и быстро высохли.

После высыхания мазок протравливают, через 15 минут химикат смывают. Следующий этап – окраску фуксином – проводят, погружая стекло в раствор красителя, чтобы не повредить жгутики при нанесении краски.

Выдержав нужное время, мазок промывают водой и высушивают. Теперь можно переходить к исследованию получившегося результата.

Техника окрашивания

Для получения окрашенного препарата нельзя просто взять кисточку, краски и отловить бактерию. Существует определенная схема работы с микроорганизмами:

  1. Приготовление мазка. На предметное стекло (стерильное) наносят каплю воды, в которую затем бактериологической петлей вносят и распределяют по поверхности лабораторный материал.
  2. Высушивание. Лишняя жидкость высушивается либо естественным путем при комнатной температуре, либо мазок немного прогревается высоко над пламенем горелки.
  3. Фиксация. Мало просто убрать воду, нужно закрепить бактерии на предметном стекле. Для этого можно использовать огонь (несколько проходов над самой горячей частью пламени) или жидкость (спирт, ацетон). После такой обработки микроорганизмы быстрее впитывают краску.
  4. Непосредственно окрашивание. Краска должна полностью покрывать всю поверхность мазка. Выдержав нужное время (для каждого красителя свое), краску убирают и промывают препарат водой.

После высыхания (обычно естественным путем) полученный результат можно использовать по назначению.

Окрашивание микроорганизмов – это целая система методов, приемов, схем, направленных на обнаружение и распознавание клеток при помощи микроскопа. Ни одно медицинское исследование или научная работа в микробиологии не обходятся без предварительной подготовки и окраски изучаемого материала.

Образование высшее филологическое. В копирайтинге с 2012 г., также занимаюсь редактированием/размещением статей. Увлечения — психология и кулинария.

Источник: https://probakterii.ru/prokaryotes/raznoe/metody-okraski-bakterij.html

Простые и сложные методы окраски бактерий

Универсальный дифференциальный метод окраски бактерий метод

Бактериоскопический метод исследования предусматривает изучение микроорганизмов в живом или фиксированном и окрашенном состоянии. Для изучения микроорганизмов в живом состоянии используют метод раздавленной капли и метод висячей капли. Наиболее часто применяют микроскопию бактерий в фиксированном и окрашенном состоянии.

Для приготовления фиксированного и окрашенного препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1-1,5 см. Если исследуют жидкий материал, то его непосредственно петлей наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе.

Для фиксации используют физические и химические методы. Для фиксации мазка физическим методом предметное стекло медленно проводят 3 раза через пламя горелки. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей фиксируют химическим методом путем погружения их на 5-20 минут в метиловый или этиловый спирт, смесь Никифорова и другие фиксирующие жидкости.

Для окрашивания микробов используют простые и сложные методы.

При простом методе фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например, водным раствором фуксина (1-2 минуты) или метиленовым синим (3-5 минут), промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Сложные методы окрашивания включают использование нескольких красителей. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других.

Окраска по Граму:

1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовый раствор генцианового фиолетового через полоску фильтровальной бумаги. Через 2-3 минуты ее снимают, а краситель сливают.

2. Наносят раствор Люголя на 1-2 минуты.

3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 секунд до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промывают препарат водой.

5. Докрашивают мазок водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в красный цвет.

При окраске по методу Грама в модификации Синевана первом этапе используют фильтровальные бумажки, пропитанные генциановым или кристаллическим фиолетовым. Для этого полоски бумаги пропитывают 1% раствором красителя и высушивают.

На фиксированный мазок помещают пропитанную красителем бумажку, заливают небольшим количеством воды и выдерживают в течение 2 минут. После этого бумажку удаляют пинцетом, сливают краску и, не промывая препарат водой, наносят раствор Люголя.

Последующее окрашивание проводят общепринятым методом.

Распределение микроорганизмов в зависимости от окраски по Граму:

1. Грамположительные бактерии:

— кокки (за исключением гонококков и менингококков);

— бациллы и клостридии (спорообразующие палочки);

— микобактерии, коринебактерии и листерии.

2. Грамотрицательные бактерии:

— некоторые кокки (гонококки и менингококки);

— все остальные палочковидные бактерии;

— все извитые формы (вибрионы, спириллы, спирохеты).

Структура бактериальной клетки

Структурные компоненты бактериальной клетки делят на 2 вида:

основные структуры (клеточная стенка, цитоплазматическая мембрана с ее производными, цитоплазма с рибосомами и различными включениями, нуклеоид);

временные структуры (капсула, слизистый чехол, жгутики, ворсинки, эндоспоры, образующиеся лишь на определенных этапах жизненного цикла бактерий).

Основные структуры.

Клеточная стенканаходится с внешней стороны от цитоплазматической мембраны. Цитоплазматическая мембрана не входит в состав клеточной оболочки. Функции клеточной стенки:

— защита бактерий от осмотического шока и других повреждающих факторов;

— определение формы бактерий;

— участие в метаболизме бактерий;

— токсичность за счет наличия поверхностных антигенов (у некоторых патогенных бактерий);

— наличие рецепторов для бактериофагов (у части бактерий).

В 1884 году датский микробиолог Ганс Христиан Грам предложил метод окраски бактерий с использованием генцианвиолета, йода, этилового спирта и фуксина. Все бактерии в зависимости от окраски по Грамму подразделяют на 2 группы: грамположительные и грамотрицательные бактерии.

Клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из одного толстого слоя пептидогликана и тейхоевых кислот. Пептидогликан (муреин) – это многослойный линейный полимер, в котором чередуются остатки N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамина. У грамположительных бактерий содержание пептидогликана составляет от 50 до 90%.

Слои пептидогликана связаны (прошиты) между собой тейхоевой и липотейхоевой кислотами. Тейхоевые кислоты выступают на поверхности клеточной стенки и являются главными антигенами грамположительных бактерий. Клеточная стенка грамположительных бактерий плотно прилегает к цитоплазматической мембране, ее толщина составляет 20-100 нм.

Грамположительные бактерии прочно фиксируют комплекс генцианвиолета и йода, не обесцвечиваются этанолом и поэтому не воспринимают дополнительный краситель фуксин, в результате чего клетка остается окрашенной в фиолетовый цвет.

Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из 2-х тонких слоев. Внутренний слой (периплазма) представлен пептидогликаномв виде тонкой непрерывной сетки.

[attention type=green]

У грамотрицательных бактерий содержание пептидогликана составляет 1-10%. Наружный слой (внешняя мембрана) состоит из липополисахарида, белков и фосфолипидов. Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-17 нм.

[/attention]

Липополисахариды всех грамотрицательных бактерий обладают токсическими и пирогенными свойствами и называются эндотоксинами.

У грамотрицательных бактерий комплекс генцианвиолета с йодом легко вымывается из клетки этанолом, и после дополнительного нанесения фуксина клетка окрашивается в красный цвет.

В некоторых условиях бактерии лишаются способности полностью или частично синтезировать компоненты клеточной стенки, в результате чего образуются протопласты, сферопласты и L-формы бактерий. Сферопласты – это бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой с сохранением элементов наружной мембраны. Они наблюдаются у грамотрицательных бактерий.

Протопласты — это формы, полностью лишенные клеточной стенки. Они образуются грамположительными бактериями. L-формы бактерий — это мутанты бактерий, частично или полностью утратившие способность синтезировать пептидогликан клеточной стенки (бактерии с дефектной клеточной стенкой).

Свое название они получили от названия института Листера в Англии, где были открыты в 1935 году.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) и ее производные.Цитоплазматическая мембрана (плазмолемма) — это полупроницаемая липопротеидная структура бактериальной клетки, отделяющая цитоплазму от клеточной стенки. Она составляет 8-15% сухой массы клетки.

Ее разрушение приводит к гибели клетки. При электронной микроскопии выявлено ее трехслойное строение. Цитоплазматическая мембрана представляет собой комплекс белков (50-75%) и липидов (15-20%). Основная масса липидов представлена фосфолипидами.

Кроме того, в составе мембраны обнаружено небольшое ко­личество углеводов.

ЦПМ бактерий выполняет следующие функции:

— барьерная функция (молекулярное “сито”);

— избирательный перенос раз­личных органических и неорганических молекул и ионов с помощью специальных переносчиков – транслоказ или пермеаз;

— превращение клеточ­ной энергии;

— репликация и последующее разделение хро­мосомы.

В процессе роста клетки цитоплазматическая мембрана образует многочисленные впячивания (инвагинаты), получившие название мезосом. По морфологическим особенностям различают ламеллярные (пластинчатые), везикулярные (имеющие форму пузырьков), тубулярные (трубчатые) мезосомы.

Цитоплазма — это содержимое бактериальной клетки, ограниченное цитоплазматической мембраной. Она состоит из цитозоля и структурных элементов.

Цитозоль — гомогенная фракция, включающая растворимые компоненты РНК, ферменты, продукты метаболизма.

Структурные элементы — это рибосомы, внутрицитоплазматические мембраны, включения и нуклеоид.

Рибосомы — органоиды, осуществляющие биосинтез белка. Они состоят из белка и РНК. Представляют собой гранулы диаметром 15-20 нм. Одна бактериальная клетка содержит от 5000 до 50000 рибосом. Рибосомы являются местом синтеза белка.

В цитоплазме прокариот обнаруживаются различные включе­ния, представляющие запасные вещества клетки. Из полисахаридов в клетках откладываются гликоген, крахмал и крахмалоподобное вещество — гранулеза. Полифосфаты содержатся в гранулах, назы­ваемых волютиновыми, или метахроматиновыми, зернами.

Нуклеоидявляется аналогом ядра у прокариот. Он состоит из одной замкнутой в кольцо двуспиральной нити ДНК, которую рассматривают как бактериальную хромосому. У нуклеоида отсутствует ядерная оболочка.

Кроме нуклеоида в бактериальной клетке обнаружены внехромосомные генетические элементы – плазмиды, которые представляют собой небольшие кольцевые молекулы ДНК, способные к автономной репликации.

Роль плазмид состоит в том, что они кодируют дополнительные признаки, дающие клетке преимущества в определенных условиях существования.

[attention type=yellow]

Наиболее распространены плазмиды, детерминирующие признаки антибиотикорезистентности бактерий (R-плазмиды), синтез энтеротоксинов (Ent-плазмиды) или гемолизинов (Hly-плазмиды).

[/attention]

К временным структурам относятся капсула, жгутики, пили, эндоспоры бактерий.

Капсула — это слизистый слой на поверхности клеточной стенки бактерий. Капсула синтезируется на наружной поверхности цитоплазматической мембраны и выделяется на поверхность клеточной стенки в специфических участках.

Функции капсулы:

— место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;

— защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;

— способность прикрепления клеток к субстрату.

Жгутики – это органы движения бактерий. Жгутики не являются жизненно важными структурами, поэтому могут присутствовать у бактерий или отсутствовать в зависимости от условий выращивания. Количество жгутиков и места их расположения у разных бактерий неодинаково. В зависимости от этого выделяют следующие группы жгутиковых бактерий:

монотрихи – бактерии с одним полярно расположенным жгутиком;

амфитрихи – бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;

лофотрихи – бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки;

перитрихи – бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Химический состав жгутиков представлен белком флагеллином.

К поверхностным структурам бактериальной клетки относятся также ворсинки и пили. Эти структуры участвуют в адсорбции клеток на субстрате (ворсинки, пили общего типа) и в процессах переноса генетического материала (половые пили). Они образованы специфическим гидрофобным белком пилином.

У некоторых бактерий в определенных условиях образуются покоящиеся формы, которые обеспечивают переживание клеток в течение длительного времени в неблагоприятных условиях — эндоспо­ры. Они устойчивы к неблагоприятным факторам внешней среды.

Расположение спор в клетке:

— центральное (возбудитель сибирской язвы);

— субтерминальное — ближе к концу (возбудитель ботулизма);

— терминальное – на конце палочки (возбудитель столбняка).

Источник: https://ekoshka.ru/metody-okraski-bakterij/

Сам себе врач
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: